网上有关“科普讲堂 | RNA样本提取与判读的方法及常见问题分析”话题很是火热，小编也是针对科普讲堂 | RNA样本提取与判读的方法及常见问题分析寻找了一些与之相关的一些信息进行分析，如果能碰巧解决你现在面临的问题，希望能够帮助到您。
RNA介绍
核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic
Acid），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A（腺嘌呤）、G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）、U（尿嘧啶），其中，U（尿嘧啶）取代了DN的T（胸腺嘧啶）。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。
RNA提取（TRlzol提取法）
1．取样，研磨（组织）： 迅速取出组织样本，在电子天平中称重约0.3-0.5 g（也可根据实际经验估测取样量），放入液氮预冷的研钵中，边研磨边加液氮，整个过程都不要使组织融化。
2．裂解：
（1）组织：按每100
mg组织加入1 mL TRIzol，继续研磨至较细粉末，将组织裂解液转移到1.5 mL 离心管中，每管约1 mL，室温放置15min以上；也可直接将研磨的较细粉末用枪头刮入已取好的含有1 mL TRIzol的1.5 mL 离心管中，4℃放置10 min，或室温放置15min以上；
（2）细胞：（悬浮细胞需预处理：4℃，3000
rpm，离心10 min，收集细胞沉淀于1.5 mL 离心管底）；弃去培养液，加入适量1xPBS洗一次，弃去1xPBS，加入1 mL
TRIzol试剂（TRIzol加入量基于细胞数（1 mL/ 0.5-1x107个）或培养瓶的面积（1 mL/10?cm2），用移液器轻吹打几次，超净台中室温放置15 min以上，转移1 mL 液体到1.5 mL 离心管中。
（3）若不马上进行提取，可放入－80℃冰箱中冻存。
3．抽提： 按0.2 mL 氯仿/ 1 mL TRIzol的比例加入氯仿，vortex 30 sec或用手剧烈摇动15 sec，室温放置2-3 min后， 4℃，12000 rpm，离心15 min；小心转移上清到一新的1.5 mL 离心管中，不要吸取中间层。
4．沉淀： 按异丙醇/上清=1:1的比例加入异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置30 min后，4℃，12000 rpm 离心15 min。弃上清，异丙醇不要回流过多，可再短暂离心，用移液器将剩余的异丙醇吸出。
5．漂洗： 加入1 mL 75％乙醇，用手指将沉淀块弹起，上下颠倒几次，4℃，12000 rpm 离心5 min。弃上清，75％乙醇不要回流过多，可再短暂离心，用移液器将剩余的75％乙醇吸出。
6. 风干，溶解： 超净台中自然干燥 5-10 min，不要真空离心干燥， RNA不要完全干透，以防不能完全溶解；用DEPC水溶解RNA，60-65℃助溶 5-10 min。
7. 定量： 进行Total RNA定量，如果不马上定量，将样品贮存于-80℃。
RNA定量
我们一般通过Nanodrop紫外分光光度计测定RNA样本在260nm处的吸光值来计算RNA含量。但是，DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，其性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。所以紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。
Nanodrop紫外分光光度计可以得到以下参数：
OD230 ：杂质（酚、糖原等碳水化合物）的吸光度；
OD260 ：核酸的吸光度；
OD280 ：蛋白质的吸光度；
OD260 /280 ：纯的RNA比值在1.5 ~2.1之间，如果比值低，表示受到蛋白质的污染；
OD260 /230 ：纯的RNA比值在2.0 ~2.5之间，如果比值低，表示受到有机物如糖、肽、苯酚等的污染。
RNA完整性鉴定
我们一般使用电泳、Agilent2100等仪器来鉴定RNA的完整
RIN值
RIN（RNA integrity number）代表RNA完整性的数值，对total RNA的完整性进行数字化的评估，范围在1 ~10，数值越接近10表明样品完整性越高，反之完整性越差，如下图所示。
RNA降解程度对各个测序项目的影响
①?转录组测序： 降解程度会影响5’ 端的数据质量；
②?micRNA测序： 由于本身的片段较小，受降解的影响较小；
③?降解组测序： 若受到外源降解，回复给内源性降解，受影响较大；
④?lncRNA和circRNA测序： rRNA去除方式建库，样本降解影响小。
原核污染对各个测序项目的影响
① 转录组测序： 一般不影响数据，轻微污染时可无视，污染较严重时需增加建库起始量；
②micRNA测序： 对数据影响较小，一般是按污染比例对数据的比对率和有效数据量产生影响，轻微污染时可无视，污染比例较高时需加测数据量；
③?降解组： 情况同转录组；
④?lncRNA和circRNA测序： 影响极大，建库方式决定了如果污染，若不给予处理，数据可能完全没法用，故对该问题需要高度警戒。
常见问题分析
得率低：
①?样品裂解或匀浆处理不彻底；
②?RNA沉淀未完全溶解。
A260/A280<1.65（RIN<7）：
?①检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高；
?②样品匀浆时加的试剂量太少；
?③?匀浆样品时未在室温放置5分钟；
?④?吸取水相时混入了有机相；
?⑤?RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：
? ①组织取出后没有马上处理或冷冻；
? ②待提取RNA的样品保存在了-5至-20℃；
? ③细胞在用胰酶处理时过度；
? ④溶液或离心管未经RNase去除处理；
? ⑤电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。
DNA污染：
①样品匀浆时加的试剂量太少；
②样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液蛋白聚糖和多糖污染：沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1mlTRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。
关于百奥益康
北京百奥益康医药科技有限公司（以下简称“百奥益康”）是天津百奥医药科技有限公司的全资子公司，公司由资深的单细胞高通量测序技术科学家团队创立，致力于打造中国先进的肿瘤单细胞诊疗品牌，为科研和临床提供单细胞诊断仪器、诊断试剂、医学诊断技术分析等全套解决方案，高效赋能肿瘤个体化诊疗。
百奥益康是国内为数不多实现“研发+市场”自主大幅增长的落地团队。公司管理团队、技术团队和营销团队有丰富的单细胞领域服务和研发经验，曾成功领导打造了国内领先的单细胞科研服务团队，与10x Genomics、BD、MissionBio等国际领先的单细胞平台公司有深入合作，对单细胞检测相关技术、产品、应用有深厚积淀。依托配置合理、经验丰富的科学家团队，百奥益康实现了单细胞测序技术创新发展，能更加快捷、稳定地完成从样本处理、高通量单细胞分离、测序文库构建，到数据分析和临床意义挖掘等单细胞关键技术流程，提供涵盖单细胞诊断仪器、诊断试剂、医学诊断技术分析等在内的完整技术解决方案。?
主营业务
百奥益康科研服务以单细胞服务为主体，配以其他以高通量测序和芯片为基础的多组学服务，提供一站式的科研服务，从而实现从单细胞水平到bulk水平系统完整的解决方案。
关于“科普讲堂 | RNA样本提取与判读的方法及常见问题分析”这个话题的介绍，今天小编就给大家分享完了，如果对你有所帮助请保持对本站的关注！
本文来自作者[贝胜伟]投稿，不代表瀚智号立场，如若转载，请注明出处：https://3g.hanzhiwangluo.cn/hanzhi/532.html
评论列表（3条）
我是瀚智号的签约作者“贝胜伟”
本文概览：网上有关“科普讲堂 | RNA样本提取与判读的方法及常见问题分析”话题很是火热，小编也是针对科普讲堂 | RNA样本提取与判读的方法及常见问题分析寻找了一些与之相关的一些信息进...
文章不错《科普讲堂 - RNA样本提取与判读的方法及常见问题分析》内容很有帮助